Kinetyka reakcji enzymatycznych (część I).odt

SPRAWOZDANIE

Kinetyka reakcji enzymatycznych

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Proszę dodać stronę tytułową

Cel ćwiczenia: Badanie wpływu pH, temperatury, aktywatorów i inhibitorów na szybkość reakcji enzymatycznych.

Enzymy-  to katalizatory układów biologicznych, są godnymi specjalnej uwagi urządzeniami molekularnymi, które określają wzorzec przekształceń chemicznych. Pośredniczą również w przekształceniu różnych form energii. Najbardziej znaczącą właściwością enzymów jest ich siła katalityczna i specyficzność. Niemal wszystkie enzymy są białkami. Zwiększają one szybkość reakcji 106 razy i więcej. Wiele enzymów wymaga dla aktywności obecności kofaktorów. Kofaktorami mogą być jony metali lub małe, pochodzące od witamin cząsteczki organiczne, zwane koenzymami. Enzymy służą jako katalizatory poprzez obniżanie energii swobodnej aktywacji reakcji chemicznych.

Szybkość katalizowanej przez enzym przemiany zależy zarówno od stężenia enzymu jak i substratu. Nie są to jednak jedyne czynniki działające na kinetykę reakcji, wpływ ma także pH, temperatura reakcji, siła jonowa, stała dielektryczna środowiska oraz w niektórych przypadkach potencjał redukcyjno- oksydacyjny.

Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej.

Wzrost temparatury powoduje wzrost szybkości reakcji enzymatycznej, zgodnie z równaniem Arrehniusa. Wiąże się to ze wzrostem energii kinetycznej cząstek i większą częstotliwością ich zderzeń.

V=k*[s], gdzie k=ko*e-Ea/RT

Aktywność rośnie wraz ze wzrostem temperatury, jednakże tylko w takim zakresie temperatury, w którym enzym pozostaje stabilny. Po przekroczeniu temperatury krytycznej, następuje denaturacja termiczna enzymów, w wyniku czego aktywność gwałtownie spada. Przeciętnie szybkość reakcji enzymatycznych wzrasta dwukrotnie przy wzroście o 10°C w zakresie temperatur niedenaturujących struktury enzymu. Dla większości enzymów zmiany denaturujące zachodzą bardzo intensywnie powyżej 40- 50°C, jednak istnieją takie które wykazują odporność na inaktywujące działanie wysokiej temperatury. Są to enzymy o wysokiej termostabilności. Termostabilnosć białka enzymatycznego jest między innymi zależna od pH i siły jonowej środowiska.

Rys. 1.

Powinno być: „Rys.1.”

Wpływ temperatury na aktywność reakcji enzymatycznej.

Wpływ pH na aktywność.

Większość enzymów ma swoje optymalne pH działania. Optimum pH, obok optimum temperaturowego,

Zmieniłam kolejność ponieważ piszą Państwo przy opisie optymalnego pH o temperaturze, która była opisywana dopiero w kolejnym akapicie. Teraz jest logiczna kolejność akapitów.

to drugi pod względem znaczenia parametr środowiska charakteryzujący aktywność enzymów. Wpływ pH na aktywność enzymów wiąże się z faktem, że enzymy jako białka posiadają wiele aminokwasów ulegających jonizacji, a aminokwasy centrum aktywnego często mogą pełnić swoją rolę tylko w określonym stanie jonizacji. Mogą one występować w postaci elektrododatniego kationu, elektroobojętnego amfijonu i elektroujemnego anionu. Ładunek cząsteczki białka enzymatycznego ma istotny wpływ na jej czynność katalityczną, determinuję bowiem siłę oddziaływań wodorowych i jonowych.  Wykres zależności aktywności enzymu od pH ma najczęściej kształt dzwonowaty, czyli enzym ma największą aktywność w swoim optymalnym pH i aktywność ta spada wraz z oddalaniem się od tego punktu. Spowodowane jest to przede wszystkim trudnością w wiązaniu się enzymu z substratem a także w  pH ekstremalnym inaktywacją cząsteczki białka. Wartość optymalnego pH jest charakterystyczna dla danego enzymu, substratu i środowiska w którym zachodzi reakcja.

Rys. 2.

Powinno być: „Rys.2.”

Wpływ pH na aktywność reakcji enzymatycznych.

Aktywatory i inhibitory enzymów.

Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od obecności w układzie innych niż  enzym i substrat substancji. Wyróżniamy aktywatory które przyspieszają reakcję i inhibitory, które opóźniają katalityczne działanie enzymu. Do aktywatorów zaliczamy jony niektórych metali (Mg2+, Zn2+), substancje białkowe i niskocząsteczkowe związki organiczne, znoszące działanie inhibitorów. Wśród inhibitorów wyróżniamy inhibitory specyficzne bądź niespecyficzne. Pierwsze z nich działają na obniżenie aktywności ściśle określonych enzymów. Natomiast inhibitory niespecyficzne są to jony metali ciężkich, które wiążą się łatwo i w sposób nieodwracalny z wszystkimi białkami. Powodując rozległe zmiany ich konformacji. Enzymy mogą ulegać inhibicji przez małe cząsteczki bądź jony. W inhibicji nieodwracalnej inhibitor łączy się kowalencyjnie z enzymem lub wiążę się z nim tak silnie, że jego dysocjacja jest bardzo powolna. Natomiast inhibicję odwracalną charakteryzuje szybko ustalający się stan równowagi między enzymem i inhibitorem. Inhibitor kompetencyjny zapobiega wiązaniu się substratu z miejscem aktywnym. Współdziała z enzymem w tym samym obszarze cząsteczki co substrat. Zmniejsza on szybkość reakcji przez zmniejszanie liczby cząsteczek enzymu związanych z substratem. Inhibitory niekompetencyjne wiążą się z enzymem w innym obszarze cząsteczki niż substrat.

α-Amylazy- są to enzymy szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Jest to grupa enzymów zaliczanych do hydrolaz, rozkładających skrobie i inne polisacharydy

Proszę wymienić te inne polisacharydy.

np. glikogen. Skrobia jest zbudowana z 2 frakcji, nierozgałęzionej amylozy w której występują wiązania α-1,4-glikozydowe i z amylopektyny, która zawiera oprócz powyższego wiązania, także wiązanie α-1,6-glikozydowe i tym samym jest rozgałęziona. α-Amylaza dokonuję rozkładu wiązań α-1,4-glikozydowych w skrobi tym samym, powodując rozpad łańcucha na krótsze fragmenty zwane dekstrynami. Dokładny przebieg tego procesu można śledzić za pomocą barwnych reakcji z roztworem jodu w KJ. Nierozłożona skrobia z tym odczynnikiem daje niebieskie zabarwienie, krótsze łańcuchy dekstryn zwane amylodekstrynami- kolor fioletowy. Natomiast jeszcze krótsze łańcuchy hydrolizy (erytrodekstryny) barwią się podczas reakcji z α-amylazą na czerwono-brunatny kolor, a achrodekstryny nie dają barwnej reakcji, gdyż mają za krótkie łańcuchy by mogło do niej dojść. Aktywność α- amylazy można określić na podstawie pomiaru przyrostu stężenia cukrów redukujących uwalnianych z substratu przez enzym.

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH ( CZĘŚĆ I )

Wpływ pH, temperatury aktywatorów i inhibitorów na szybkość reakcji enzymatycznych

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

Zestawienie wymaganych odczynników, materiałów i sprzętu:

- roztwory α- amylazy bakteryjnej Bacillus subtilis i pleśniowej (Aspergillus niger),

- 1% koloidalny roztwór skrobi,

- roztwór jodu w jodku potasu,

- 1% alkaliczny roztwór kwasu 3’, 5’- dwunitrosalicylowego (DNS),

- roztwory buforowe o pH 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8,

- 1% NaCl,

- 1% CuSO4.

- probówki ze statywem, pipety 1 i 5 ml, pipetki pasterowskie, płytki porcelanowe, fotokolorymetr,  łaźnie wodne o temperaturze: 40, 50, 60, 70, 80 i 100˚C.

WYKONANIE ĆWICZENIA

2.1. Wpływ pH na aktywność α- amylazy.

Do 6 probówek odmierzono po 1 ml roztworów buforowych o pH: 3, 4, 5, 6, 7 i 8. Do każdego z odmierzonych roztworów buforowych dodano pipetą po 2 ml koloidalnego roztworu skrobi. W międzyczasie przygotowano płytki porcelanowe z zagłębieniami, do których wprowadzono po 2 krople roztworu jodu w jodku potasu.

Do zbuforowanych roztworów skrobi, dodano pipetą w równych  odstępach czasu, np. co 15 sekund, po 1 ml roztworu α- amylazy. Zawartość probówek natychmiast wymieszano. Przy pomocy pipetek pasterowskich pobierano co 15 sekund próby każdego
z hydrolizatów, przenosząc je na uprzednio przygotowane płytki z roztworem jodu w jodku potasu. Zaobserwowane zmiany zabarwienia, wskazujące na stopień rozkładu skrobi
w danej próbie umieszczono w Tabeli 1.

Pobieranie prób hydrolizatów kontynuowano do momentu, aż jedna z nich w reakcji z jodem w jodku potasu zabarwiła się na jasnobrunatny kolor. W tym momencie, poczynając od pierwszej probówki, w równych odstępach czasu, dodano pipetą do wszystkich sześciu hydrolizatów po 3 krople roztworu jodu w jodku potasu. Natychmiast wymieszano zawartość probówek i zaobserwowano  zabarwienie powstałe na skutek reakcji dekstryn -  produktów hydrolizy -  z roztworem jodu w jodku potasu.

Tabela 1. Wyniki obserwacji stopnia hydrolizy skrobi.

W sprawozdaniu proszę pisać tylko to o co chodzi w komentarzu, a sam komentarz pominąć.

Optymalne pH działania badanego preparatu α- amylazy na skrobię wynosi 5. Gdyż doszło do hydrolizy skrobi, powstały achrodekstryny czyli krótkie łańcuchy do których jod wnika w małej ilości. W tym pH enzym był najbardziej aktywny.

2.2. Wpływ temperatury.

Do 6 probówek odmierzono po 1 ml koloidalnego roztworu skrobi i po 0,5 ml buforu o pH optymalnym (wyznaczonym w punkcie 4.1.)  dla działania badanego preparatu
α- amylazy. Inkubowano każdą z probówek w ciągu 5 minut w następujących temperaturach: pokojowa (na stole laboratoryjnym), 40, 50, 50, 70 i 80˚C (łaźnie wodne).

Po 5 minutach, gdy temperatura w probówkach ustaliła się na żądanym poziomie, do każdej
z nich dodano po 0,5 ml roztworu α- amylazy. Natychmiast dokładnie wymieszano  zawartość probówek i inkubowano je nadal w podanych temperaturach w ciągu 3 minut.

Dokładnie po 3 minutach od momentu dodania α- amylazy do koloidalnego roztworu skrobi, pobrano 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej i wprowadzono do uprzednio przygotowanej probówki, zawierającej 0,5 ml roztworu DNS. Wymieszano i umieszczono na 5 minut we wrzącej łaźni wodnej, po czym schłodzono i dodano 4 ml wody destylowanej. Wymieszano ponownie i zmierzono absorbancję roztworu przy długości fali równej 540 nm wobec próby odczynnikowej, zawierającej 0,5 ml wody destylowanej zamiast mieszaniny reakcyjnej.

Z krzywej wzorcowej odczytano stężenie cukrów redukujących w mieszaninie reakcyjnej, w przeliczeniu na maltozę.

Pomiar z wykorzystaniem DNS- w środowisku zasadowym (pH 5- optymalne pH działania  α- amylazy na skrobię) grupy nitrowe kwasu 3,5-dinitrosalicylowego redukowane są do grup aminowych, a jednocześnie cukry ulegają utlenieniu do odpowiednich kwasów- onowych. Powstające pochodne aminowe maja barwę pomarańczowa, a pomiar intensywności zabarwienia oznacza się przy długości fali 550 nm.

Przykładowe obliczenie stężenia cukru w temperaturze równej 50oC.

A540 0,1 – 0,2 mg maltozy/ml

1,702- x mg maltozy/ml

x=1,702*0,2/0,1

x=3,404 mg maltozy/ml

Wyniki umieszczono w Tabeli 2.

Tabela 2. Podsumowanie wpływu temperatury