MECHANIZM DZIAŁANIA INHIBITORÓW ENZYMÓW
Podział inhibitorów:
· Inhibitory o działaniu odwracalnym - produkty i substraty reakcji występują w stężeniach przekraczających wartości optymalne;
· Inhibitory o działaniu nieodwracalnym - wśród nich wyróżniamy:
1. Inhibitory kompetycyjne
2. Niekompetycyjne
3. O działaniu mieszanym;
Realnie, rodzaj inhibitorów (jego przynależność) rozważamy na podstawie sposobu ułożenia krzywych szybkości reakcji.
Hamowanie kompetycyjne:
· Inhibitor oddziałuje jedynie z wolną formą enzymu
· Nie zmienia maksymalnej szybkości reakcji
· Zmianie ulega stałe Michaelisa
· Zmniejsza się powinowactwo Enzymu do Substratu
Wzbudzony kształt centrum aktywnego nie umożliwia czynności katalitycznych
Hamowanie niekompetycyjne:
· Inhibitor zmienia aktywność katalityczną enzymu
· Maksymalna szybkość reakcji ulega zmniejszeniu
· Wartość stałej Km, a tym samym powinowactwo enzymu do substratu nie ulega zmianie
· Cząsteczka inhibitora przyłączona swoistym innym niż substrat miejscu wiązania uniemożliwia przyjęcie przez enzym konformacji pozwalającej na oddziaływanie kontaktowych z enzymem i hamuje reakcje enzymatyczne
Inhibitory tego typu mogą wiązać się z wolnym enzymem lub/i kompleksem E-S np.
§ związki chelatujące kationy metali niezbędnych dla aktywności enzymu;
§ związki zdolne do odwracalnego tworzenia pochodnych z gr. funkcyjnymi enzymu istotnymi dla jego aktywności;
Hamowanie mieszane:
Powstało z połączenia dwóch powyższych metod hamowania.
· Inhibitor może wiązać się z wolnym enzymem jak również z kompleksem E-S
· Hamowanie to prowadzi do jednoczesnego obniżenia maksymalnej szybkości reakcji i powinowactwa enzymu do substratu
· Przykład: hamowanie przez substrat reakcji, gdzie ze wzrostem stężenia substratu zmniejsz się szybkość rekcji
Odwracalność omówionych mechanizmów hamowania uzyskujemy po usunięciu jego przyczyny. Może to być:
Ø Zwiększenie stężenia substratu przy hamowaniu kom petycyjnym
Ø Usunięcie inhibitora przy hamowaniu mieszanym i kom petycyjnym
Ø Zmniejszenie stężenia substratu lub usunięcie produktu ze środowiska reakcji przy hamowaniu nadmiarem substratu
Inhibitory o działaniu nieodwracalnym:
Ø Działanie polega na uszkodzeniu cząsteczki enzymu w wyniku chemicznej modyfikacji jego struktury. Tworzące się trwałe, kowalencyjne pochodne enzymu blokują grupy niezbędne do jego aktywności (np. jodooctan wiąże nieodwracalnie grupy -SH).
Ø Zastosowanie - do selektywnych modyfikacji - w celu badania struktury lub mechanizmu działania.
METODY IZOLOWANIA I OCZYSZCZANIA ENZYMÓW
Źródłem enzymów są:
ü Narządy
ü Tkanki roślinne i zwierzęce
ü Płyny ustrojowe
ü Zawiesiny komórkowe pochodzące z hodowli drobnoustrojów lub innych komórek
Przed rozpoczęciem izolowania dokonuje się wyboru materiału biologicznego w oparciu o wiedzę związaną z umiejscowieniem poszczególnych enzymów w narządach, tkankach, komórkach lub ich środowiskiem w przypadku enzymów pozakomórkowych.
Następnie analizujemy jakie warunki procesu (temp, pH, siła jonowa), sposób dezintegracji i ekstrakcji oraz metody izolowania i oczyszczania są najbardziej optymalne dla zachowania skomplikowanej struktury enzymów decydującej o jej aktywności.
Zasadniczą sprawą jest przeprowadzenie badań wstępnych dotyczących stabilności danego enzymu w różnych temperaturach, w środowiskach o różnym pH i sile jonowej podczas zamrażania i odmrażania. Pozwala to na wybór warunków zapewniających stabilność enzymu w czasie preparatyki.
Należy przy tym pamiętać, że wyniki mogą być nieco odmienne na różnych etapach oczyszczania. Uwzględniamy również możliwość zastosowania stabilizatorów enzymów, dobieramy najbardziej przydatne kryteria oceny czystości enzymu.
Etapy izolowania:
Pierwszym etapem izolowania enzymów zawartych w komórkach jest ich uwolnienie do roztworu, czyli ekstrakcja. Etap poprzedza przygotowanie materiału biologicznego, z którego chcemy pozyskać enzym .
Przygotowanie materiału:
Do przygotowania materiału, w celu ułatwienia ekstrakcji stosuje się:
o Rozdrabnianie tkanek miękkich
o Wirowanie różnicowe
o Zamrażanie i odmrażanie
o Dezintegracja ultradźwiękami
o Odwadnianie i mielenie tk. twardych
o Homogenizacja
o Szok osmotyczny
*Narządy i tkanki miękkie można rozdrobnić w maszynkach do mięsa, a następnie poddać homogenizacji
*Twarde tkanki odwadnia się acetonem i rozdrabnia w młynie uderzeniowo - nożowym
*Zawiesiny komórkowe można homogenizować stosując wielokrotne zamrażanie i odmrażanie; szok osmotyczny; ultradźwięki; energiczną homogenizację; niektóre enzymy lityczne.
Wybór metody prowadzi najczęściej nie tylko do przerwania błon komórkowych, ale też w dużej mierze do zniszczenia błon organelli komórkowych, a to z kolei nie zawsze jest korzystne. Gdy chcemy izolować enzymy związane z poszczególnymi substancjami komórkowymi, musimy wstępnie izolować te elementy. Stosuje się w tym celu wirowanie różnicowe.
Schemat izolowania enzymu z wątroby:
Wątroba
Homogenizacja( 0,25M sacharozy, 600obr/min)
Homogenat (organelle subkomórkowe,
tk.łączna, naczynia krwionośne, przewody żółciowe)
sączenie
Organelle subkomórkowe
Wirowanie (600g/min)
Osad: jądra i nierozbite komórki
Ultrawirowanie (15000g/min)
Osad: mitochondria, lizosomy, peroksysomy
Ultrawirowanie 100000 g/1h
Osad: rybosomy i fragmenty retikulum
+ frakcja rozpuszczalna cytoplazmatyczne
Strukturę wyodrębnionych organelli komórkowych niszczy się przez zamrażanie i odmrażanie lub homogenizację. Wszystkie omówione działania mają na celu ułatwienie ekstrakcji, czyli przeprowadzenie enzymów w formę rozpuszczalną.
Ekstrakcja
Jest to przeprowadzenie enzymu w formę rozpuszczalną. Kryterium to obecność enzymu w suprenatacie po wirowaniu przy 105000 g przez 1,5 - 2 h.
Enzymy występujące w cytoplazmie i przestrzeni komórkowej. Wiele z nich łatwo przechodzi do rozcieńczonych roztworów elektrolitu o pH 4-8. Stosując odpowiednie pH i stężenie elektrolitu można stosować proste wirowanie homogenatu.
Gdy enzymy są we frakcji subkomórkowej lub są związane z błonami komórkowymi skuteczność ekstrakcji podnosi uprzednie przeprowadzenie materiału w proszek acetonowy.
Do ekstrakcji stosuje się też: odczynniki osłabiające interakcje enzymu z błonami poprzez oddziaływanie hydrofobowe elektrostatyczne oraz mostki utworzone przy udziale metali.
Najczęściej wykorzystuje się w tym celu:
o Alkalizację roztworów (pH 9-11)
o Elektrolity o dużym stężeniu
o Związki cheltujące
o Rozpuszczalniki organiczne
o Detergenty tj. butanol, etanol, sole kw. Żółciowych; triton -X-100, SDS
Np. *Mitochondrialna dehydrogenaza bursztynianiowa najłatwiej ulega ekstrakcji przy pH 10-12
*Elastaza z granulocytów w buforze zawierającym KCl lub w roztworze mocznika zbuforowanego przy pH 8,7 i zawierającego 0,5%Tweenu 80
IZOLOWANIE ENZYMÓW Z ROZTWORU
A. Metody oparte na różnicach w rozpuszczalności
1. Frakcjonowanie solami nieorganicznymi
Rozpuszczalność białek zależy od siły jonowej roztworu, a więc od
*stężenia i wartościowości występujących w mieszaninie jonów
*pH roztworu i jego temperatury
Zwiększając siłę jonową roztworu osiąga się taką wartość, przy której rozpuszczalność białka będzie równa jego stężeniu. Następnie białka zaczynają wypadać z roztworu. Wykorzystano to do frakcjonowania mieszanin białkowych przez selektywne wysalanie. Najczęściej wykorzystuje się do tego celu sole z 2-wartościowymi anionami (dają roztwory o wysokiej sile jonowej). Największe zastosowanie ma siarczan amonowy, ale stosuje się też siarczan magnezowy i sodowy. Temp. procesu najczęściej 2-4oC, pH niezbyt odległe od punktu izoelektrycznego enzymu. Sole dodaje się do ekstraktu w stanie stałym lub w postaci nasyconych wodnych roztworów, przy ciągłym mierzeniu aby zapobiec nierównomiernemu wzrostowi stężenia. Metodą prób i błędów ustala się stężenie soli, przy którym wytrąca się 80-90% danego enzymu. W prawidłowo opracowanym procesie ok. 10% enzymu traci się poza wybranym przedziałem stężenia soli, z czego ok. 5% powinno wytrącić się przy niższym stężeniu, a pozostałe 5% powinno pozostać w roztworze. Zasada dotyczy wszystkich metod opartych na różnicach rozpuszczalności. Wysalanie jest metodą ładgodną, straty enzymów są minimalne.
2. Frakcjonowanie rozpuszczalnikami organicznymi (aceton, etanol, dioksan)
Jest rzadziej stosowane niż wysalanie bo może prowadzić do niebezpiecznej denaturacji enzymów.
Liczne enzymy pozostają stabilne w środowisku tych rozpuszczalników zwłaszcza gdy proces prowadzimy przy obniżonej temperaturze. Najczęściej stosuje się temp. ujemną dochodzącą do kilkudziesięciu stopni poniżej zera.
Podobnie jak podczas wysalania:
o pH roztworów nie powinno być odległe od punktu izoelektrycznego enzymu;
o siła jonowa wystarczająco duża aby zminimalizować jonowe interakcje między białkami w mieszaninie.
Praktycznie stosuje się stężenia elektrolitów odpowiadające roztworowi NaCl o stężeniu 0,1 -0,2mol/l. Wyższe stężenia zwiększają rozpuszczalność białek w mieszaninie woda - rozpuszczalnik organiczny i zwiększają objętość wirowanych zawiesin. W przypadku zbyt dużej rozpuszczalności rozdzielanych białek w roztworach stosowanego rozpuszczalnika możne je przeprowadzić w kompleksy z jonami 2-wartościowymi dodając do wyjściowego roztworu Mg(II) lub Zn(II) do stężenia 0,02mol/l. Tworzące się kompleksy są trudniej rozpuszczalne, co pozwoli na zmniejszenie objętości dodawanego rozpuszczalnika organicznego. Technika procesu jest podobna jak w przypadku wysalania.
3. Frakcjonowanie rozpuszczalnymi polimerami niejonowymi (np. glikol polietylenowy, dekstran).
Rozpuszczalność w tych roztworach polimerów zależy od wielkości i kształtu białka. Trudność techniczną sprawia uwolnienie otrzymanej frakcji od polimerów, wymagające: *ultra sączenia; *sączenia molekularnego; *zastosowanie wymieniaczy jonowych.
4. Frakcjonowanie przez denaturację termiczną.
Wykorzystuje się ją do otrzymywania enzymów charakteryzujących się dużą termostabilnością. Ekstrakt ogrzewa się do temp. nieco niższej od tej, przy której oczyszczany enzym traci aktywność. Prowadzi to do wytrącenia wielu białek towarzyszących. W procesie można wykorzystać ochronny wpływ substratu lub ligandów łączących się specyficznie z enzymem (pozwala to na podwyższenie temperatury bez inaktywacji enzymu i zapewnia większą efektywność denaturacji białek towarzyszących).
5. Frakcjonowanie przez zmianę pH lub obniżenie siły jonowej.
Zmiana pH roztworu wyjściowego w kierunku niższych wartości prowadzi do usunięcia białek towarzyszących, których punkt izoelektryczny leży w pobliżu danej wartości pH. Podobny efekt można uzyskać obniżając siłę jonowądo bardzo niskich wartości np. przez dializę wobec bardzo rozcieńczonych roztworów buforowych lub wodnych.
6. Krystalizacja
Stosuje się ją w przypadku znacznie oczyszczonych preparatów. Do stężonego roztworu białka enzymatycznego dodaje się najczęściej siarczan amonowy do pierwszego zmętnienia, po czym bardzo powoli zwiększa się stężenie soli Lubnie zwiększając jej stężenia zmienia się pH roztworu. Wykrystalizowany enzym wykazuje wyższy stopień oczyszczenia niż pozostający w roztworze. Niektóre enzymy krystalizują także w reakcjach glikolu polietylenowego lub alkoholu.
B. Metody chromatograficzne
1. Sączenie molekularne
2. Chromatografia jonowymienna
Zastosowanie wymieniaczy jonowych do izolowania i otrzymywania enzymów związane jest z jonowym charakterem białek. Zamiast niezbyt przydatnych do tego celu żywic jonowych stosuje się celulozowe, dekstranowe, agarozowe wymieniacze jonowe, które otrzymywane są poprzez wbudowanie obdarzonych ładunkiem grup nierozpuszczalnego, obojętnego nośnika (grupy o ładunku dodatnim wiążą aniony anionity, grupy o ładunku ujemnym kationy kationity).
Wybierając rodzaj wymieniacza bierzemy pod uwagę jego grupę funkcyjną, pH środowiska oraz znak i wielkość ładunku izolowanego enzymu.
3. Chromatografia na hydroksyapatycie
Mechanizm funkcjonowania na hydroksyapatycie Ca10(PO4)OH2 polega na wiązaniu białka z adsorbentem zarówno grupy ujemne jak i dodatnie. Wiązanie grup dodatnich jest słabsze w środowisku soli metali jednowartościowych.
4. Chromatografia powinowactwa biologicznego
Odpowiedni ligand (zw. z którym enzym wiąże się swoiście) np. analog substratu, efektor allosteryczny, koenzym, przeciwciało unieruchamia się w fazie stałej przez połączenie go z nierozpuszczalnym obojętnym nośnikiem (najczęściej pochodną agarazy).
5. Chromatografia hydrofobowa.
Opiera się an różnicach oddziaływań miedzy unieruchomionymi na odpowiednim nośniku związku hydrofobowym a hydrofobowymi obszarami cząsteczki białka. Najczęściej stosowane są: alkilowe i amino alkilowe pochodne agarozy.
6. Chromatografia kowalencyjna.
Jako nośnik wykorzystuje się preparaty reagujące z białkami zawierającego fr. sulfhydrylowe. Tworzą one połączenie poprzez wiązanie - S - S -. Związane białka można uwolnić wprowadzając do układu drobnocząsteczkowe związki tiolowe np. 2-merkatoetanol.
7. Chromatografia na unieruchomionych jonach metali ciężkich.
Wykorzystuje się unieruchomione jony miedzi, cynku, rtęci np. Affi-Gel 501 (pochodne agarozy z podstawioną grupą) Jony te mogą tworzyć połączenia z gr. -SH białek oraz z imidazolem histydyny. Uwolnienie związanego białka kolumny wymaga dodania do roztworu elucyjnego związków chelatujących lub zmiany pH i siły jonowej.
ELEKTROFERYCZNE TECHNIKI PREPARATÓW
1. Elektroforeza preparatywna w żelu poliakrylamiodowym
Proces ten prowadzi się w specjalnym urządzeniu. Frakcje białkowe wędrują przez całą długość kolumny wypełnionej żelem, a w momencie opuszczania złoża wymywane są na zewnątrz strumieniem buforu przepływającym prostopadle do kierunku biegu elektroforezy i zbierane są w kolektorze frakcji.
2. Ogniskowanie izoelektryczne.
Najczęściej stosowane do badania jednorodności białek. Można też stosować do celu preparowania. Wyboru dokonujemy po przeprowadzeniu eksperymentów wstępnych. Po uzyskaniu odpowiedniego ekstraktu stosujemy gwarantującą usunięcie większości materiału balastowego, pozwalającego na znaczne zmniejszenie objętości i dającą się wykorzystać na dużą skalę. Dalsze postępowanie powinno być tak zaplanowane, aby w następujących po sobie etapach zostały wykorzystane metody opierające się na różnych zasadach rozdziału.
Jako pierwszy etap stosuje się najczęściej wysalanie siarczanem amonowym (można uzyskać w niektórym przypadku nawet 10-krotny wskaźnik oczyszczenia).
Jeżeli dysponujemy odpowiednim swoistym sorbentem a siła jonowana i białka balastowe nie przeciwdziałają swoistej interakcji możemy w pierwszym etapie wykorzystać chromatografię powinowactwa biologicznego (czasem pozwala to na wyizolowanie enzymu w stanie czystym już w pierwszym etapie).
Jako etap pierwszy stosuje się też czasami chromatografię hydrofobową, rzadziej jonowymienną. Jeżeli pierwszym etapem ma być jakikolwiek rodzaj chromatografii kolumnowej, to należy tak dobrać warunki procesu , aby częściowy e...
beeola