Syntetyczna biologia
W ujęciu genomicznym potrafimy ustalić sekwencje całego genomu danej bakterii.Trzeba pamiętać, ze jeśli analizujemy wszystkie odcinki występujące w danej biocenozie, te fragmenty pochodzą z różnych układanek i jest trudno odtworzyć całe genomy. Czasem to się udaje, ale zwykle nie poszukuje się całej sekwencji genomu - a szukamy często genów, które można wykorzystać w celach biotechnologicznych. Chcemy móc je później zsyntetyzować i wstawić do genomu bakterii lub też stworzyć cały syntetyczny genom cały genom.
Biologia syntetyczna - dziedzina na styku biologii molekularnej i inżynierii genetycznej, celem jest stworzenie sztucznych systemów biologicznych wzorowanych na naturalnych. Nadrzędny cel to tworzenie mikroorganizmów, które bylibyśmy wstanie użyć do konkretnych celów np. produkcja energii, czy etanolu, z którego można by zrobić biopaliwa.
Jeden z twórców biologii syntetycznej – prof. Wacław Szybalski
Krótki film co to jest biologia syntetyczna.
https://www.youtube.com/watch?v=rD5uNAMbDaQ
Schemat pokazuje co to biologia syntetyczna – obecnie na etapie naszego zaawansowania jesteśmy w stanie syntetyzować prawie cały genom bakteryjny, powsadzać tam geny, które nas interesują i umieścić całość w pustej bakterii lub bakterii z 1 chromosomem. Po podziale, jedna komórka da początek zmodyfikowanemu organizmowi.
Na początek doświadczenie z przed kilku lat. Należało wybrać najprostszy układ: syntezowany w laboratorium fag bakteryjny, bo niewielki (ponad 5000 pz), który można wprowadzić do komórek bakteryjnych i łatwo zobaczyć czy jest w stanie się namnażać i replikować w kom bakterii przez analizę łysinek. Projekt polegał na tym, że za pomocą odpowiednich primerów można było namnażać określone fragmenty faga, potem je łączyć, w końcu cały długi zlinearyzowany genom faga, pociąć enzymem restrykcyjnym, połączyć w całość z wektorem i włożyć do E.coli. Można za pomocą syntetycznych primerow i reakcji PCR odtworzyć cały materiał genetyczny faga poza komórką bakteryjną, w której się namnaża. W genom faga trzeba było wsadzić geny markerowe (czy charakterystyczny układ nukleotydów albo gen, którego produkt będzie dawał barwne reakcje) żeby móc następnie udowodnić, że mamy do czynienia z syntetycznym genomem faga a nie naturalnym. Okazało się, że łatwo można taki genom wprowadzić do kom bakteryjnych. Oczywiście istnieją jakieś mutacje po namnożeniu się komórek, ale zwykle są one ciche.
Czy można to samo zrobić z genomem bakteryjnym? Craig Benter podjął to wyzwanie.
Użyto bakterii Mycoplasma (mają najmniejsze genomy, wiec synteza jest łatwiejsza, w porówaniu do innych bakterii). Jednym z etapów była delecja poszczególnych genów i obserwacja jaka jest minimalna ilość genów, wystarczająca żeby bakteria żyła w komórce w warunkach laboratoryjnych. Można było przekonać się czy to możliwe, pobierając materiał genetyczny z jednego gatunku Mycoplasma i wszczepiając go do drugiego gatunku Mycoplasma.
Mycoplasma capricolum do Mycoplasma mycoides.
W innym doświadczeniu użyto Mycobacterium genitalium. Wymagało to wstępnym doświadczeń. Na początku jedną bakterie pozbawiono chromosomu i wszczepiono inny chromosom. Potem okazało się, że można dołożyć drugi dodatkowy chromosom i później po podziale komórki bakteryjnej, pojawiają się potomne komórki, gdzie jedna zyska chromosom z innej bakterii, a druga naturalny.
Zrobiono hybrydyzacje kolonijną, komórki rozcieńczono i wysiano na płytki agarowe. Zastosowano przeciwciało poliklonalne przeciwko tej bakterii, z której pochodził chromosom i można było stwierdzić, że otrzymujemy sygnały pozytywne.
Innym sposobem jest dwukierunkową elektroforeza. Obecność nowego chromosomu możemy wstwierdzić porównując wyniki z wyjściowymi szczepami. Część białek jest wspólna a część charakterystyczna tylko dla tego szczepu, którego chromosom przeniesiono.
Nie tylko próbowano przekonać się, że można przenieść jeden chromosom z jednej bakterii A do B, a także ile genów można usunąć z bakterii o najmniejszym genomie. Geny usuwano za pomocą transpozonów – przerywano gen. Minimalna liczba genów to 350. Usunięto ok 200 genów.
Próbowano zsyntezować syntetyczny chromosom. Wprowadzono kilka genów markerowych by przekonać się, że jest to ten wprowadzany chromosom. Powinny być rozrzucone po całym chromosomie i musiały zawierac gen markerowy np. B galaktozydazę, gdzie dodając substratów łatwo można zobaczyć czy gen istnieje.
Genom mycoplasma podzielono na odcinki – 100 kaset zachodzących na siebie. Wprowadzając liczne znaki wodne, markery itd. wybrano takie miejsca, żeby nowa bakteria syntetyczna nie była patogenna. Te odcinki były syntetyzowane w laboratorium chemicznie, później były łączone np. za pomocą rekombinaz, ligaz. Cały genom czy sztuczny chromosom można było oczyścić w żelu agarozowym i wprowadzić do drożdży i póżniej w zależności jaki system restrykcji i modyfikacji występował u danej bakterii , trzeba było poddać je odpowiedniej metylacji wprowadzić do komórek bakteryjnych.
Bakteria z takimi dwoma chromosomami, dzieli ma materiał genetyczny na pół. Powstają kom, gdzie jedna ma sztuczny, a druga dziki. Ponieważ można było wprowadzić markery, łatwo później wysiewając na płytki stwierdzić gdzie jest syntetyczny genom.
Te kasety łączyło się za pomocą in vitro O-rekombinacji, która umożliwia łączenie mniejszych lub większych fragmentów w probówce.
Co z tego wynika: à możliwe stworzenie organizmu, który zaczął swoje życie od replikacji syntetycznego chromosomu – wszystko zależy od kosztów syntezy DNA. Sztuczne chromosomy mogą zawierać pojedyncze geny lub całe ciągi znalezione u innych bakterii, które będą przydatne do tworzenia biopaliw, szczepionek itd.
W jaki sposób my możemy poszukiwać tych wartościowych dla nas genów, które później możemy syntetyzować w warunkach laboratoryjnych i wprowadzić do naszych bakterii?
Funkcjonalna część metagenomiki poszukuje określonych sekwencji za pomocą reakcji PCR.
Niektóre antybiotyki poliketydowe, mają konserwatywne fragmenty enzymów występujące u wielu gatunków bakterii i można użyć ich jako sond do poszukiwania odcinków DNA, które kodując jakieś enzymy o nowych właściwościach bądź do poszukiwania określonego fenotypu w mieszaninie e-DNA. W funkcjonalnej metagenomice nie szukamy sekwencji DNA, szukamy informacji zakodowanej w DNA i przetłumaczonej na białka – analiza proteomiczna.
Micro array już coraz mniej jest używane. Żeby poszukać tego fenotypu czy jakiejś cechy, trzeba pobrać próbke zagęścić ją, wyizolować DNA. DNA sklonować w jakies wektory jeśli chcemy znac fenotyp i szukac fenotypu.
Planując tworzenie takiej biblioteki, musimy wiedzieć czego chcemy szukać i dobrać odpowiednie wektory.
· Krótkie fragmenty DNA – do poszukiwania niewielkich genów, plazmidy
· Gdy chcemy szukać zespołów genów to wtedy trzeba to e-DNA delikatnie pofragmentować, kosmidy
· Długie fragmenty DNA – BAC, fosmidy
Alternatywna metoda poszukiwania bakterii produkujących dany związek:
Metoda mikrohodowli bakterii – czyli gdy nie izolujemy DNA, tylko staramy się stworzyć bakteriom warunki w jakich żyją naturalnie.
Działa to w ten sposób, że w z gleby czy wody pobiera się próbkę, zagęszcza się ją, a pojedynczą bakterie zamyka w mikrokapsułce. Uzyskujemy zbiór setek tysięcy kapsułek, które umieszcza się je w kolumnie i dostarcza im się naturalnego środowiska. Wtedy większość zaczyna się dzielić, uzyskujemy mikroreaktory. Później umieszczamy każdą kapsułkę w wielodołkowej płytce i przeprowadzamy testy na obecność odpowiednich produktów, które dana bakteria może produkować. Te mikrokapsułki mają odpowiednio malutkie pory, ale składniki odżywcze przenikają. Gdy jakiś produkt nas zainteresuje, możemy wyciągnąć z tej kapsułki DNA i za pomocą technik wysokoprzepustowego sekwencjonowania, możemy ustalić sekwencje genomu i poszukać interesującego nas fragmentu odpowiedzialnego za produkcje danego metabolitu. Albo te wyciągnąć bakterie i zwiększyć skale.
Pierwszą biblioteką metagenomiczną, była biblioteka genów, które warunkują oporność na antybiotyk.. Chciano się dowiedzieć w jakich środowiskach ile mamy genów odpowiedzialnych za odporność na antybiotyki.
Pobierano próbkę gleby, izolowano z tego DNA, klonowano do wektorów plazmidowych, ligowano i transformowano komórki E.coli. Oglądamy czy są jakieś kolonie oporne na dany antybiotyk. Najczęściej jest to 1 enzym, który inaktywuje antybiotyki. Okazało się, że w niewielkim fragmencie gleby znaleziono 13 odrębnych enzymów, które powodują inaktywacje antybiotyków aminogklikozydowych.
Praktycznie nie mamy już antybiotyków na niektóre bakterie. Nas ciekawi jak można poszukiwać tych genów oporności i gdzie występują.
Kanamycyna, gentamycyna – hamują syntezę białek w komórkach bakteryjnych, wiążą się do podjednostki 30S rybosomu.
Chodziło o to żeby znaleźć geny oporności w tych organizmach, których nie potrafimy hodować w warunkach laboratoryjnych. Mikroorganizmy te stają się donorami, w wyniku horyzontalnego transferu genu, oporności antybiotyków dla patogenów. Tak jest w rolnictwie, gdzie do pasz dodawano się antybiotyków żeby zwierzęta szybciej przybierały na masie. W efekcie powstawał super patogen z odpornością na kilka antybiotyków, o silnej wirulentności.
Przykład oporności na antybiotyki aminoglikozydowe
è Produkty genów w różny sposób potrafią je inaktywować. Najwięcej ze szczepów klinicznych, ale tez rolniczych czy weterynaryjnych.
Podejście poszukiwania nowych antybiotyków
Staramy się ekspresje tej biblioteki metagenomowej przeprowadzać w innych organizmach niż E.Coli.
Sigma podjednostka polimerazy swoiście rozpoznaje sekwencje promotorową. Ekspresja sigma podjednostek jest zależna ściśle od warunków środowiskowych, dlatego często nie możemy zmusić mikroorganizmu żeby produkował nasz antybiotyk bo sigma podjednostka nie ma sygnału ze środowiska ze ten zespół genów ma ulegać ekspresji. Druga rzecz ze gdy stosujemy E.coli jako organizm w którym chcemy uzyskać produkcje danego antybiotyku to E.Coli najczęściej nie ma takich sigma podjednostek, które by rozpoznawały ten dany nasz promotor. Tym się różnią miedzy sobą bakterie ze jedne mają inny zestaw podjednostek sigma od drugich. A wiec musimy szukać alternatywnych mikroorganizmów, które prawdopodobnie będą mieć odpowiednie podjednostki . Są to kłopoty jakie napotykamy przy ekspresji genów ze środowiska, gdy te mają swoje promotory – czyli problem to różne czynniki transkrypcji.
Częstość kodonów jest inna u różnych rodzajów bakterii – w związku z czym pula rzadkich aa-tRNA również jest inna u różnych mikroorganizmów, więc często nie dochodzi do translacji na pożądanym poziomie. Często tez bakterie mają odmienny system sekrecji czyli wydzielania tego związku na zewnątrz. A wiec może być produkowany, ale nie jest widzialny.
Dobrymi kandydatami zamiast E.Coli mogą być Streptomyces, zwłaszcza, gdy szukamy antybiotyków z gleby.
Synteza antybiotyków poliketydowych.
Acidobakterie, również bakterie glebowe. Opisane stosunkowo niedawno – okazało się ze nie potrafimy ich hodować w warunkach laboratoryjnych. Analiza 16S rRNA wykazała ze najwięcej w glebie mamy tych bakterii – od 30-50% sekwencji bibliotek metagenomowych 16S, wskazuje ze to są bakterie reprezentujące tą klasę bakterii.
Szereg szczepów Acidobakterii zanalizowano w laboratorium, określono sekwencje genomów i zidentyfikowano szereg podjednostek sigma, których nie ma u E.Coli. Próbowano przenieść te podjednostki do E.Coli i zwiększyć prawdopodobieństwo, że gdy wklonujemy gen czy zestaw genów to ulegną one ekspresji dzięki obecności nietypowych podjednostek sigma. Z kolei użycie takich podjednostek sigma w szczepie E.Coli przetestowano na genach oporności na antybiotyki B laktamowe.
Jak działają antybiotyki B laktamowe i enzymy, które je rozkładają. Kilka rodzajów B laktamaz.
Mechanizmy oporności: modyfikacja antybiotyku, hydroliza antybiotyku.
...
Petroc