TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

Strony 153-192

Jeśli nie dopilnujemy temperatury ilość potencjalnych miejsc hybrydyzaji wzrosnie i mozliwie jest zwiaznie się primera w niewlasciwej pozycji

Wpływ temperatury na hybrydyzację:

Wyznaczenei idelanej temperatury opiera się o tak zwane temperaturę topnienia (Tm), która to jest typowa dla rozdzielenia się dwóch nici. Idelana temperatura do hybryduzacji powinna być niższa od Tm o 1-2 C. Tm wyznacozne eksperymentalnie pochodzi ze wzoru:

4*(G+C) + 2*(A+T), gdzie G,C,A,T to ilości odpowienich nukleotydów.

9.3 Badanie produktów PCR

PCR zwykla otwiera serie eksperymentów dotyczacych DNA. Po PCR można przperowadzic elektroforeze, knoowanie lub sekwencjonowanie otrzymanych produktów.

Elektroforeza:

Rezultatem prawidlowo przperowadzonego PCR powinien być 1 pasek na sciezce żelu agarozowego, jeśli ich nie ma lub jest ich wiecej niż w 1 pozycji to oznacza ze cosp oszlo źle podczas PCR. Czasami oddatkowo dokonuje się modyfikacji produktu PCR – npp. tnie się go restryktazą aby zbadać miejsca ciecia w produkcie – wówczas mówimy o o analizie RFLP.

Moóżan orwniez na podstrawei rozmiaru produktów wnioskwoac o pewnych cechach DNA – stosuje się tu technikę profilowania DNA. W innych badaniach obecnosc lub jej brak produktow po PCR stanowi ważna ceche. Przykladme może być przeszukiwanie poprzez PCR biblioteki konów. Wydaje się to bycnuzacym zadaniem, lecz jego zlaetą jest szybkosc i mozliwosc przprowadzenia kilku PCR jednocześnie. Poza tym czasami używa się redukujacej czas techniki kombinatorycznego screeningu.

Elktorforeza produktów po PCR:

Kombiantoryczny screening:

Klonowanie:

Zastosowanie wielu technik wymaga aby produkty po PCR, były ligowane i wklonowywane od wektora. Wydaje się to trywialne, lecz przysparza problemów. Pierwszy tyczy się końców produktów po PCR, nie są one tępę, ani lepkie, gdyż poliemraza Taq loswo dodoaje kilka adenozyn na 3’ końcach. Usuwa się je egoznukleazą, lecz jest to trudne, gdyż nie da siep rzewidziec czy nukleaza nie usuine oprocz dodanych adenozyn również wewnetrznych nukleotydów produktu, jednym słowem cieżko zatrzymac jej procesywność w okreslonym momencie.

Pierwszym roziwazaniem jest uzycie wektora który zaiwera ponadnormatywne końce T, które można zligowac z koncówkami A produktów PCR. Takei wektory otyrzymuje się także porpzez dialnie polimerazy Taq, w obecności samego dTTP, lub poprzez ligację topoizomerazami. Drugie rozwiazanie ot uzywanie podczas PCR primerów z miejscami ciecia. Po PCR trkatuje się produkty restryktazmai, które utworzą lepkie końce w miejscach primerówych. Co oczywiste miejsca ciecia nie mogą wystepowac w primerach i w naszym DNA powielanym. Ich obecnosc tylko w primerach jest zapewniana poprzez dodanie do nich do 5’ końca specjalnego rozszerzenia zawierajacego unikalne miejsce ciecia. 

Pierwsze roziwaznie, uzycie specjalnego wektora:

Drugie rozwiazanie, Uzywanie odpowiednich primerów:

Problemy z polimerazą Taq:

Wiekoszsc poliemraz zawiera w sobie aktywność zdolną do korekcji błędów. Nazywa jest „proofreading” i polega na usuwaniu błednych nukleotydów idąc od końca 3’ w kierunku 5’.

Poliemraza Taq jest pozbawiona tej zdolności, co oznacza ze otrzymwane kopie materiału wyjsciowego mogą być błędne. Pziom błedów wynosi 1 zły nukleotyd na 9000 wstawionych i jeśli taki bład zajdzie wp ierwszym cyklu jest powielany w nastpenych. Nie stanowi to problemu w przypadku sekwencjonwania badanego produktu ponieważ badany material jest porownywny, przez co latwo można wylapac kopie zawierająca błąd.Rpoblem pojawia się przy klnoowaniu gdzie zla kopia może doporowadzic do powstania błędnych rekombniantów i położyc caly eksperyment. Dzieje się tak rzadko, lecz jest to czynnik powodujący że DNA po PCR jest raczej studiowany niż klonowany.

Rezultat błedów przy klonowaniu:

9.4 PCR w czasie rzeczywsitym

Ilosć otrzymanego produktu jest wprost zlaezna od DNA na starcie, stąd PCR mozep osluzyc do okreslenia ilsociowego materiału DNA. Zaleznosc ta przedstwiona jest w tabeli:

W ilosciowym PCR (qPCR) porownujemy ilsoc produktu która powinnismy otrzymać, majac wiedze o ilości początkowej, z tą którą w rzeczywistosaci otrzymalismy. Ilość otrzymaną w rzeczywsitosci ocenia się po intensywnosci paska po elektroforezie w żelu agarozowym. Chociaz jest to latwe do wykonania, pomiar jest nieprecyyzjny, gdyż gestosc owego paska jest trudno rozróżnialna.

Porównanie gęstosci pasków z paskiem markerowym:

qPCR obecnie wykorzystuje się rzadko, stooswaną metodą jest raczej PCR w czasie rzeczywistym. W tej metodzie wykorzystuje się dwa spsooby mierzenia na biezaco ilości materiału rosnacego w czasie:

-z użyciem barwnika, który łączy się z dupleksem DNA, im wiecje DNA powstaje, tym wieksze zuzycie barwnika, lecz istniej zagrozenei przeszacowania, gdyż barwnik może polaczyc się z dupleksami błednymi, które powstaly po niespecyficznej hybrydyzacji primera.

-z użyciem sondy reporterowej, która przekazuje sygnął po zwiazaniu się z produktem PCR, sonda wiaze się ltyko z prawidlow zhybrydyzowanymi primerami, co zmniejsza ryzyko błędu. Każda sonda zawiera dwa znaczniki na końcach 5’ i 3’ – sygnal fluorescencyjny i wygaszacz sygnału; gdy są blisko siebie wygaszacz niep ozwlaa na emisje syngału fluorescencyjnego, dzieje się tak gdy sonda nie jest zwiazana z dupleksem DNA. Zwiaznaie się z sondy DNA pozwlaa na rozciagniecie obu końców do tej pory bedacych blisko siebie i uwolnieniu sygnału fluorescencyjnego, rejstrowanego przez aparat. Aparat następnie analizuej sygnały i porownuje je z wzorcowym, odpowiadajacym znanej ilości produktu. Po prownaniu synałow – wzorcowego i z naszej próby możemy odczytac ilość naszego produktu. Również można porownac ilości produktow w kolejnych badaniach PCR (9.19) – krzywa która osiaga maksymalny poziom po mnijeszej ilości cyklow zawiera najwiecej PCR, na obrazku jest to krzywa niebieska, nieco mniej produktu zawiera krzywa czerwona, najmniej krzywa zielona. 

Sonda reporterowa(quenching= wygaszacz):

Odczyt wyniku:

oś y - natężenie sygnału

oś x – ilość cyklów

threshold = próg odbioru sygnału

kolejnosc od próby która zawierala najwiecej produktu: niebieska, czerwona, zielona

PCR okrelsa standardowo ilość DNA, np. do okreslenia postepu infekcji patogenem. Rzadziej, ale również może śłużyć okreslaniu ilości RNA w próbce, co ma znaczenei przy monitorowaniu aktywnosci komórek rakowych, które jak wiadomo nadekspresjonują białko wytwarzajac wieksze niż potrzeba ilości RNA.

PCR dla RNA:

Jak przeprowadzamy takie PCR? Odpowiedizą jest uzycie odwrotnej transkryptazy PCR, która konwertuje RNA do cDNA i a nastepnie otrzymane cDNA jest traktowane normlanymi działąniami PCR.

ROZDZIAŁ 10

Sekwencjenowoanie genów i genomów

10.1 Metodologia

Dotychczaso amwailaismy dizalnia potrzebne od klonowania genów. Teraz przyjrzymy się psobom ich sekwencjonowania i dokladnej analizy, już po klonowaniu. Rozwazymy:

-techniki otrzymywania sekwencji nukleotydowej pojedynczego genu

-metody używane do oceny funkcji i stopnia ekspresji genu

-techniki do oceny całego genomu

Prawdopsodobnie najwazniejsze z nich jest sekwencjonowanie DNA, które najpierw blyo używane od pojedynczych genów, a obecnie do całych genomów.

Istnieje kilka procedur do zdobycia informacji o sekwencji DNA, lecz najpopuilarniejsza z nich to metoda terminacji łańcucha, wynaleziona przez Freda Sangera i kolegów w połowie lat 70. Jej ważna zlaetą jest mozliwosc automatyzacji i prostota wykonania co ma szczegolne znaczenei przy sekwencjonowaniu całego genomu. Obecnie można poprwadzic odkrywanie jednoczesnie 96 skewencji podczas jednego cyklu sekwencjonowania tą metodą. Dalej nie jest to wystarczające tempo dla genetyków, i dlatego wynalezli oni pirosekwencjonowanie. Stosunkowo niedawno odrktya metoda (1998) pozwala na przeprowadzenie masowych rownoległych analiz które generuja tysiace informacji w tmy samym czasie.

Metoda terminacji łańcucha (metoda Sangera):

Metoda opiera się na obserwacji ze dupleks DNA rózniący się dlugoscia o zaledwie 1 nukleotyd może być oddzielony od drugiego na żelu agarozym, przez co można otrzyamc serie paskow która będzie odpowiadac dlugosciom 50-150 nukl. , z których kazda kolejna będzie o jeden dluzsza od poprzedniego. Tak czułe rozdzielenie na żelu, zapewnia elektorforeza.

Możliwosci rozdzielcze elektroforezy:

Material , którym dysponujemy musi być jednoniciowym DNA. Pierwszym krokiem jest przygotwanie syntetycznych primerów, które posłużą jako start do replikacji. W obecnosci substratów – dNTPów – replikacja bedzie zachodzic aż do wyczerpania ich w mieszaninie, lub zakonczenia matrycy. W metodzie Sangera tak się nie dzieje, gdyż oprocz normalnych substratów mieszanina zawiera również dideoksynukleotydy –ddATP, ddCTP,ddGTP,ddTTP. Każdy z nich jest wyznakowany fluorescencyjnym znacznikiem. Polimeraza może do nici wlaczyc zarówno normalny nukleotyd jak i jego dideoksyodmianę, lecz po właczeniu dideoksynukleotydu, elongacja łańcucha zostaje zatrzymana, z powodu braku grupy 3’-OH w dideoksynukleotydzie. Ponieważ mieszanina zawiera również normlane nukleotydy, terminacja łancucha może zdarzyc się w doowlnym moemncie, niekoniecznie blisko primera. Rezultatem jest zbior cząsteczek o rózniej długosci, z ktoreych kazda konczy się dideoksynukleotydem, którego wyznakowanie powoduje detekcje, który z normalnych nukleotydow zastepuje i ustalenie jego pozycji w matrycy. W tmy momoencie do gry wkrzacza elektoroforeza, która rozdizlea w zleu precyzyjnie wszystkie fragmenty, które koncza się swiecacymi znacznikami. Detektor identyfikuje ddNTPy na koncach lanuchów i drukuje gotowa sekwencję obu nici.

Terminacja elongacji łańcucha:

Detekcja znaczników w metodzie Sangera:

Każda polimeraza jest zdolna do replikacji drugiej nici, jeśli tylko ma primer, jednak nie kazda nadaje się do sekwencjonowania. Dzieje się tka, ponieważ niektóre majam ieszane zodlnosci, jak np. egzonukleazową objawiajaca się zdolnoscia do degradacji lancucha w kierunku 5’- 3’ i 3’- 5’. Obie maja zly pwlyw na sekwencjonowanie. Aktywność 5-3 powoduje usuwanie nukleotydów z 5; konca co zmienia dlugosc nowopowstałej nici, zas druga z aktywnosci powoduje usuanie ddNTpów co nie umozliwia terminacji wydluzania łańcucha.

Aktywności egzonukleazowe polimeraz:

Zatem na początku uzywano polimerazy Klenowa, która niep osiada tych wlasciwsoci, lecz charakteryzuje się slabowitą procesywnoscia. Żeby uniknac tych problemow zsyntetyzowano sztucznie nowy enzym – sekwenazę, która jest zmodyfikowaną polimerazą z bakteriofaga T7. Nie dosc ze nie posiada ona właściwosci egzonukleazowych do tego jest bardzo procesywna.

Jak już wiemy jako materiału wyjsciowego(matrycy) w metodzie sangera potrzeba jednoniciowego DNA, otrzymamy je na kilka sposobów: korzystajac ze znago nam faga M13, który produkuje jednociowe, koliste DNA, które jednak może być bardzo krotkie, gdyż wektor z faga nie przechowuje insertów dluzszych niż 3 kb. Zatem plazmidowe wektory są lepsze, lecz wymagają modyfikacji:

-jednociowe DNA otrzymuje się przez denatruacje w alkalicznych warunkach lub przez gotowanie, lecz wymaga aby DNA wp lamidize bylo pozbawione zaniecyszczeń, zwlaszcza bakteryjnego DNA

-fagemidy również produkują jednoniciowe DNA, w dodatku przechowują fragmenty 10 kb i dłuzsze

Problem zapotrzebowania na jednoniciowe DNA można obejsc również uzywajac termicznego cyklu sekwencjonowania. Jest to metoda zblizona do PCR, z ta roznicą że używa się tylko jednego primera, i dodawane są ddNTPy. Ponieważ jes tylko jeden primer, tylko jedna nić jest kopiowana, i produkt alkumuluje się liniowo, a nie eksponencjonalnie. Obecnosc ddNTPów powoduje tremrinacje syntezy łańcucha i podobnie jak w standardowej metodzie sagera jest odczytywane dzięki aparatom, przetwarzajacym sygnały fluorescencyjne. Dla tej odmiany metody sangera, można użyć dowolnego wektora.

Termiczny cykl sekwencjonowania:

Primer ma decydujacy wplyw w metodzie sangera:

W pierwszym etapie tej metody, primer przylacza się do jednoniciowej matrycy. Jego rolą jest dostarczneei informacji dla polimerazy, który obszar ma kopiowac, co oznacza ze primer zanacza region który ma być sekwencjonowany. Podobnie zatem jak w PCR, konstrukcja primerów ma decydujace znaczenie. Najczesciej uzywany jest uniwerslany primer, którego koniec 3’ jest przyległy poczatkowi insertu DNA w wektorze.

Zatem polimeraza rozpoczyna replikacje od pierwszego nukleotydu insertu. Jeśli insert jest ldugi można użyć uniwerslanego primera z drugiego jego konca, lub uzywac wewnętrnych primerów(internal pirmiers), które opdoiwadajom wewnetrznym sekwencjom insertu.

Uzycie uniwersalnych primerow, rozszerza mozliwosc sekwencjowania w jednym kierunku, podczas, gdy uzycie uniwerslanego primera z drugiej strony wymuszałoby syntezę w obu kierunkach.

Pirosekwencjonowanie:

Ta metoda jest drugą po met. Sangera, użyteczną do sekwencjonowania DNA, a jje zleta jest brak koniecznosci angazowania dodatkowych technik jak elektrofoerezam jak to ma miejsce w przypadku metody Sangera. Jest szybsza i podobnie jak porpzednai metoda, może ulec automatyzacji i rownoleglemu skewencjonowaniu, które poszerza jej mozliwsoci do sekwencjonowania fragmentów do 1000 Mb w jednej szarży.

Piroanailiza również wymaga jako materiału poczatkowego jednoniciowego DNA, które jest otrzymwane jak już wiemy przez alkaliczną denaturację lub odpowiednie wektory. Po zwiazaniu primera druga nic jest kopiowana bez udziału ddNTPów, lecz normlanych nukleotydów, których kolejnosc wstawiania jest odczytywana na biezaco.

Dodanie nukoetydu na rosnacym łancuchu niesie ze sobą, błysk chemiluminescencji, która pocohdzi od pirofosofranu dolaczanego do nukleotydu, który jest konwertowany przez sulfurylazę w reakcji której towarzysyz owy błysk. Oczywisce jeśli dodamy wszystkie nukleotydy, zobaczymy serie nierozroznianych bylskow przez caly czas, co nie da nam żadnych przydatnych informacji. Dlatego nukleotydy dodawane są pojedynczo, każdy z towarzszyaca mu nukleotydazą. Jeśli nukeotyd nie zostanie dodany przez polimeraze do łańcucha, zostanie zdegradowany, zanim dodamy nastepny. Jeśli zas zostnaie dodany otrzymamy błysk. I tak dodowane są kolejne nukleotdy a nic jest sytematycznie wydluzana. Proces ten byłby powolny jeśli mielibysmy go wykonywac recznie, dlatego zostął poddany automatyzacji.

Masowe rownoległe pirosekwencjonowanie:

Piroanliza wykonywana jest czesciej na genomowym DNA niż na porduktach
PCR lub klonach. DNA jest ciete na fragmenty 300-500 bp i każdy jest ligowany do pary adaptorów, każdy do jednego z końców. Ich rola dotyczy umolziwienia feagmnetom DNA przyłączenia się od malych, metalowych koralików. Dziej się tak, gdyż do 5’ konca lewego adapotra jest przytlaczona biotyna, a do pierwszego z koralikow jest zwiaza streptawidyna, która ma olbrzymie powinowactwo do biotyny. Daltego framnent DNA zostaje przez to polaczenie biotyna-strpetawidyna polaczony z metalowym koralikiem. Stosunek fragmentów DNA do korlaików jest dobierany tak, aby na każdy fragment przypadał koralik. Każdy taki fragnent jest amplifikowany przez PCR, wiec do sekwencjonowania jest dostarczona ich wystarczająca ilość. Teraz adaptory mogą splenic swa drugą rolę – stanowią miejsce przyłączenia primerów, a ponieważ każdy adaptor ma taką samą sekwencję możemy do wszystkich fragmnetów uzywać tych samych primerów. Jeśli PCR przeprowadza się natychmiast, wtedy to, co otrzymamy jest mieszaniną wszystkich produktów, która nie pozwoli nam na uzyskanie pojedynczych sekwencji każdego z nich. Dlatego każdy fragment musi być ropzatrywany oddzielnie. Aby to uczynic, PCR przeprowadza się w emulsji oleju, w której każdy koralik jest zamieszkały we własnej wodnej kropelce w emulsji. Każda kropla zawiera wszystkie odczynniki niezbędne do PCR, i jest fizycznie oddzielona od wszystkich innych kropli przez barierę zapewnianą przez składnik oleju z emulsji. Po PCR, wodne krople są przeniesione do studni na plastikowy pasek, więc nie jest jedną kroplą, co oznacza obecność po jednym produkcie PCR na studzienkę, a reakcje pirosekwencjonowania prowadzone są w każdej studzience.

Pirosekwencjonowanie:

Masowe równoległe pirosekwencjonowanie:

10.2 Jak zsekwencjonowac genom?

Pierwszą całkowicie zskewencjonowaną czasteczką DNA był genom bakteriofaga ϕX174, liczaczy 5386 nukleotydów. Stało się to w roku 1975, ale już 6 lat pozniej grupa profesora Sangwera dokonal pewnego zeskwencjonownaia ludzkiego genomu mitochondrilanego a rok pozniej opislai oni calkowicie genom faga λ. Dzieisaj sekwencje ldugosci 100-200 kb są poznawane rutynowo. Dzisiejsze projekty dotycza poznawania genomow calych organizmow. Ich wielkosc dla przykladowych organizmow zawarta jest w tabeli:

Molziwe jest rowniezp oznanie genomow zwierząt wymarłych, jak np. mamuta

Pojedynczy cykl piroanalizy odkrywa sekwencje 150 bp, a reakcja sangera do 750 bp. Skoro ludkzi genom ma wielkosc 3,200,000,000 bp potrzeba ogromnej ilości cykl – nie jest to problemem przy pelnej automatyzacji sprzetow, lecz problemem jest analiza porownawcza potrzymanych wynikow, kiedy to z miliona poznanych sekwencji krótkich fragmentów, stanowiacych pewna ukladanke, trzeba zlozyc pelna sekwencje calego genomu. Używane są do tego dwie strategie:

1. strategia „shotgun” w kotrej tniemy clay genom na setki różnych sekwencji, które są przyrownywane do siebie i laczone w dlugie fragmenty
2. strategia kontigów klonów, kiedy to przed etapem wlasciwego laczenia, jest wykonywane pre-łączenie, które prowadzi do powstania kontigów klonów, które są seriami klonów o zidentyfikowanej sekwencji. Kolejne kontigi są dopasowywane od siebie dzięki czemu dostajemy pelna mape kontigową.

Obie strategie:

Strategia „shotgun” opiera się na przyrownywaniu do siebie krótkich sekwencji pocietego genomu i pokrywaniu nimi calego genomu. Łatwo jednak jest popelnic blad lub przeoczyc jakis fragment. Prawdopodobienstwo pomyłki rośnie wraz ze wzrostem wielkości genomu, stąd shotgun jest uzywany do identyfikacji genomów bakteryjnych, które są z reguly mniejsze.

Dzięki tej strategii poznano w pelni sklad genomu bakterii hemophilus influenzae, która była pierwszym wolno zyjacym organizmem , którego genom poznano.

Eksperyment wyglądał następująco. Genom bakterii (1830 kb), pocieto na krotkie fragmenty, nie uzywajac restrykaz, lecz dzięki sonikacji, która zmniejsza prawdopodobienstwo luk w sekwencji i zapewnia losowe ciecie. Po elektroforezie w zleu agarozowym zdecydowano się pzostawic fragmenty o dlugosci 1,6-2 kb do dlaszych badan, gdyż takie iwelkosci ograniczlay ilos potrzebnych klonow i zarazem zmniejszaly koszta zwiazane z preparacją. Po klonowaniu wykonano 28,643 eksperymenty Sangera, na 19,867 klonach. Odrzucono 4339 sekwencji, gdyż były za krotkie, a pozstałe przez 30 h analizował komputer, co przyniosło w efekcie 140 sekwencji kontigów. Pozostął problem luk w genomi, które musialy zostać wypełnione. Najkrotsza do tego droga były ekepserymnety hybrydyzacji sond z klonami biblioteki genomowej faga λ. Robiono to tak , że przygotowywano sondy, którego skaldaly się z sekwencji oligonukleotydowych, ktorewg wynikow powinny być kolo sieibe, sondy poddawano hybrydyzacji z bilioteką. Jeśli obie zhybrydyzoaly w tym samym miejscu, wówczas można było mowic o tym ze te fragmnety leza kolo siebie i luke miedzy nimi można dopelnic sekwencja faga λ, do której hybrydyzowały obie sondy.

Cały eksperyment:

Wypełnianie luk:

Problemy z sekwencjonowaniem shotgun:

Shotgun dziaal dobrze z malymi skewencjami, gdyż zawieraja one malo powtorzeń. Sekwencjep owtorzone to takie które w identycznej postaci powtarzaja się co jakis czas w genomie. Powoduje to olbrzymi problem gdyż te sekwencje, można interpetowac blednie i początek jednej skojarzyc z koncem drugiej mimo ze są od siebie oddalone w genomie o wiele zasad.W ten sposób „gubimy” spory kawałek genomu, co ilustruje ten rysunek:

Z tego powodu shotgun rzadko jest uzywany do interpretacji eukariotycznych genomów, które zawieraja duze ilości rozporoszonych powtorzeń.

Stategia kontigów klonów:

Ta meotda nie cierpi na limitacje wielkością genomu, lecz jest drozsza i czasochlonna. Buduje się w niej obraz genomu, poprzez ukladanie jeden obok drugiego nakladajacych się na siebie kontigów. Kontigi klonów powinny być jak najdłuższe, aby zmnijeszyc ich calkowita ilość potrzena do pokrycia genomu. Dlatego używane są nosniki klonów takie jak kosmidy czy BAC, które maja duze pojemności. Do zmontowania ze soba poszczegolnych sekwencji używa się różnych technik.

1.      Jedną z nich jest wedrowanie po chromosomie. Aby je rozpoczac dowolny klon jest wybierany, oznakowany i uzywany jako sonda do przeszukania bibl...