Preparat mikroskopowy , barwienie metodą Grama.doc

MIKROBIOLOGIA – mgr Paulina Usarek

WYKONANIE PREPARATU MIKROSKOPOWEGO:

1.       Rozmaz:

Prosty preparat mikroskopowy sporządzamy na szkiełku podstawowym w postaci tzw. rozmazu. Na czyste, odtłuszczone i opalone w płomieniu palnika szkiełko nanosimy kroplę soli fizjologicznej 0,85% i ezą nanosimy jedną lub kilka kolonii bakterii. Ezą łączymy bakterie i kroplę soli fizjologicznej, rozprowadzając płyn z bakteriami po powierzchni, tworząc rozmaz. Preparat mona też przygotować z zawiesiny bakteryjnej w soli fizjologicznej - nakropić kropelkę zawiesiny pipetą na szkiełko podstawowe i zrobić rozmaz.

2.       Suszenie:

Preparat musi wyschnąć na powietrzu. Nie suszymy preparatu w płomieniu palnika chcąc przyspieszyć wysychanie, ponieważ obecne w płynie bakterie zostaną „ugotowane”, co może spowodować pęknięcie/zniszczenie ściany komórkowej podczas gotowania, a wówczas bakterie nie będą prawidłowo się wybarwiać, co może spowodować błędną ocenę morfologiczną.(Ponieważ barwienie metodą Grama wykorzystuje różnice w budowie ściany komórkowej pomiędzy bakteriami, prawidłowa struktura ściany ma wpływ na prawidłowe zabarwienie się bakterii.)

3.       Utrwalanie:

Dopiero suchy preparat utrwala się w płomieniu palnika. Ogrzanie w płomieniu palnika jest najpowszechniej stosowaną metodą utrwalania preparatów. Utrwalenie bakterii ma na celu zabicie bakterii, bo żywe bakterie nie przyjmują barwnika, a ponadto dzięki utrwaleniu bakterie są mocno przyczepione do szkiełka i nie zostaną spłukane z jego powierzchni podczas barwienia. 

Barwienie złożone:

W mikrobiologii najczęściej stosuje się barwienie złożone, w którym wykorzystuje się oprócz barwnika lub dwóch, również zaprawy (bejce) i odbarwiacze.

1.       Barwniki:

§         fiolet krystaliczny

§         fuksyna zasadowa lub safranina

2.       Zaprawy (bejce): substancje ułatwiające barwienie przez wzmocnienie działania barwnika. Zaprawą jest

§         płyn Lugola

3.       Odbarwiacze: substancje pozwalające na uwidocznienie pewnych bakterii lub pewnych szczegółów ich budowy, dzięki odbarwieniu innych bakterii  lub ich części.

§         alkohol etylowy (najlepiej z dodatkiem acetonu)

BARWIENIE BAKTERII METODĄ GRAMA:

Barwienie preparatów tą metodą jest barwieniem złożonym. Metoda ta została zaproponowana po raz pierwszy pod koniec XIX wieku przez duńskiego bakteriologia Hansa Christiana Grama do barwienia bakterii w histologicznych preparatach tkanek zwierzęcych. 

Barwienie metodą Grama jest złożoną metodą barwienia – wykorzystuje 2 barwniki, zaprawę i odbarwiacz. Preparat utrwala się w płomieniu palnika. Utrwalony i wystudzony preparat barwi się fioletem krystalicznym lub fioletem goryczkowym (1 – 2 minuty). Następnie spłukuje się fiolet wodą i barwi się preparat płynem Lugola (wodny roztwór J w KJ, jodyna). Po wniknięciu do wnętrza komórek bakteryjnych jod tworzy wewnątrz komórki bakteryjnej kompleks z barwnikiem, czyli z fioletem. Przez tworzenie kompleksów płyn Lugola wzmacnia działanie barwnika. Płynem Lugola zabarwia się preparat ok.1- 2 minut, po czym spłukuje wodą. Następnie preparat odbarwia się alkoholem - etanolem (z acetonem), około 20 - 30 sekund. Odbarwianie prowadzi się aż do momentu, kiedy spłukiwany alkohol jest bezbarwny. Barwny, fioletowy kompleks wymywa się z komórek o cieńszych ścianach komórkowych (gramujemnych) i te komórki odbarwiają się alkoholem, natomiast nie wymywa się z komórek o grubych ścianach komórkowych (gramdodatnich) i te komórki pozostają fioletowe.

Ostatnim barwnikiem jest safranina lub fuksyna. Jest to drugi barwnik. Safranina jest ciemno różowa i wybarwia bakteria na różowo. Jest to barwienie kontrastowe. Safranina wybarwia na różowo zarówno komórki gramdodatnie jak i gram ujemne, jednak na ciemno fioletowych komórkach gram dodatnich jasnego, różowego barwnika nie widać. Gramujemne komórki odbarwione na bezbarwny kolor przez alkohol zabarwią się na różowo, natomiast w przypadku komórek gramdodatnich, z grubymi ścianami komórkowymi, które zatrzymały fioletowy kompleks, różowy kolor będzie niewidoczny.

Barwienie jako metoda diagnostyczna:

Klasyczna, szybka metoda diagnostyczna. Precyzyjna identyfikacja bakterii nie jest możliwa (nie przydzielimy bakterii go gatunku, ani nawet rodzaju czy rodziny na podstawi preparatu mikroskopowego), ale morfologia i sposób barwienia oglądanego mikroorganizmu ogranicza liczbę prawdopodobnych czynników etiologicznych, dostarcza podstaw do ustalenia empirycznej terapii przeciwbakteryjne

Literatura:

Życie bakterii – Władysław J. H. Kunicki-Goldfinger,

Mikrobiologia – różnorodność, chorobotwórczość i środowisko – Abigail A. Salyers, Dixie D.Whitt, S

2